Доктор наук Иван Петрович Чебурков собрался проводить интересный эксперимент. Он решил выяснить, к каким последствиям приведет вставка пяти аминокислот в фермент многооксигеназу, который недавно открыл. Он подготовил все необходимое, но вдруг вспомнил, что должен срочно уезжать на конференцию. Поэтому он попросил своего ученика поставить эксперимент без него. У ученика есть схема плазмиды (рисунок 1) и последовательности трех вставок (рисунок 2). Одна вставка используется собственно для опыта, две другие вставки - контрольные. То есть при их использовании нужный белок заведомо не получится. Профессор успел сказать ученику, что и плазмиду, и вставки нужно разрезать рестриктазами BamH1 и EcoRI. Но прежде, чем ставить эксперимент, ученику нужно найти вставку для опыта и отличить ее от контрольных. И понять, в чем же заключаются контроли. Помогите ему. Нарисуйте вставки после их обработки рестриктазами. Для каждой из вставок объясните подробно, используется она для опыта или контроля и почему.
Справочная информация.
Плазмида - это небольшая кольцевая ДНК длиной несколько тысяч пар нуклеотидов, способная к самостоятельной репликации в клетке. Плазмиду можно разрезать и вставить любой нужный исследователю фрагмент ДНК. Например, ген белка. Плазмиду с нужным геном помещают в клетку. Клетки размножают в питательной среде. С гена, встроенного в плазмиду, синтезируется белок. Этот белок можно выделить из клетки и изучить дополнительными методами. А еще можно изучить, как синтез этого дополнительного белка влияет на жизнедеятельность клетки.
Чтобы выяснить роль отдельных участков белка, в ген этого белка вносят искусственные изменения (именно это хочет сделать профессор Чебурков). Затем вставляют измененный ген в плазмиду и изучают как описано выше.
Разрезают плазмиды, ДНК нужного гена и ДНК вставок, которые хотят в этот ген поместить с помощью ферментов-рестриктаз. Каждая рестриктаза узнает строго определенный участок ДНК и вносит в него разрыв.
Например, рестриктаза BamН1 режет ДНК так (знаком 5' обозначается конец ДНК, несущий фосфат, знаком 3'- несущий рибозу со свободной 3'-гидроксильной группой):
Рестриктаза EcoRI режет ДНК вот так:
Образуются концы с выступающими нуклеотидами (их называют "липкие концы"). С их помощью можно "склеивать" разные молекулы. Необходимые для прочного соединения фосфоэфирные связи затем вносит фермент лигаза, так что "склеенные" молекулы становятся полноценными цепями ДНК (или кольцами ДНК, как в нашем случае). Если обработать рестриктазами плазмиду и добавить к ней фрагмент ДНК, обработанный этими же рестриктазами, он "вклеится" в плазмидную ДНК.
Рисунок 1. Плазмида с геном многооксигеназы, обработанная рестриктазами BamH1 и EcoRI.
Рисунок 2. Последовательности вставок.
Ответ
Во вставках присутствуют участки узнавания рестриктазами: в левой части BamHI, в правой части - EcoRI. Эти участки расположены на расстоянии 6 нуклеотидов от концов вставок. Это делается потому, что, если поместить их прямо на краях, рестриктаза не узнает и не разрежет их. Такова особенность этих ферментов, которую учитывают в реальных экспериментах. Учли и мы в данной задаче.
Вставка 1 содержит последовательность пяти аминокислот. Именно она используется для опыта профессора Чебуркова.
Вставка 2 содержит стоп-кодон ТГА. Это значит, что трансляция остановится на этом месте, и полноценный белок синтезирован не будет. Следовательно, эта вставка используется в контрольном эксперименте.
Вставка 3 содержит дополнительный нуклеотид, который сдвинет рамку считывания. В результате с этого места начнет синтезироваться совсем другой белок. Поэтому эта вставка тоже используется в контрольном эксперименте.
Контрольные эксперименты ставят для того, чтобы отличить истинный результат от фонового шума. Например, в нашем случае помещение в клетку любой плазмиды может вызвать метаболические сдвиги. Поэтому в качестве контрольных используют плазмиды с неработающими генами белков. Изменения в метаболизме, вызванные этими контрольными плазмидами, считают фоновым шумом
Критерий оценки. Правильно нарисованные вставки после обработки рестриктазами- 2 б. Подробное объяснение для каждой из трех вставок - 3б.